ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಹಸ್ತಕ್ಷೇಪ ಅಂಶಗಳು

ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಕೆಲವು ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸುವ ಅಂಶಗಳು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಎದುರಾಗುತ್ತವೆ.
PCR ನ ಅತಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂವೇದನೆಯಿಂದಾಗಿ, ಮಾಲಿನ್ಯವು PCR ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವ ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ತಪ್ಪು ಧನಾತ್ಮಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡಬಹುದು.
ತಪ್ಪು-ಋಣಾತ್ಮಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ವಿವಿಧ ಮೂಲಗಳು ಸಮಾನವಾಗಿ ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿವೆ. ಪಿಸಿಆರ್ ಮಿಶ್ರಣದ ಒಂದು ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಗತ್ಯ ಭಾಗಗಳು ಅಥವಾ ವರ್ಧನೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಸ್ವತಃ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಿದರೆ ಅಥವಾ ಮಧ್ಯಪ್ರವೇಶಿಸಿದರೆ, ರೋಗನಿರ್ಣಯದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಅಡ್ಡಿಯಾಗಬಹುದು. ಇದು ಕಡಿಮೆ ದಕ್ಷತೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು ಮತ್ತು ತಪ್ಪು ನಕಾರಾತ್ಮಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.
ಪ್ರತಿಬಂಧದ ಜೊತೆಗೆ, ಮಾದರಿ ತಯಾರಿಕೆಯ ಮೊದಲು ಸಾಗಣೆ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಶೇಖರಣಾ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಿಂದ ಗುರಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಸಮಗ್ರತೆಯ ನಷ್ಟವು ಸಂಭವಿಸಬಹುದು. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನ ಅಥವಾ ಅಸಮರ್ಪಕ ಶೇಖರಣೆಯು ಜೀವಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳ ಹಾನಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು. ಜೀವಕೋಶ ಮತ್ತು ಅಂಗಾಂಶದ ಸ್ಥಿರೀಕರಣ ಮತ್ತು ಪ್ಯಾರಾಫಿನ್ ಎಂಬೆಡಿಂಗ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ವಿಘಟನೆ ಮತ್ತು ನಿರಂತರ ಸಮಸ್ಯೆಯ ಕಾರಣಗಳಾಗಿವೆ (ಚಿತ್ರ 1 ಮತ್ತು 2 ನೋಡಿ). ಈ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಅತ್ಯುತ್ತಮವಾದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಣವು ಸಹ ಸಹಾಯ ಮಾಡುವುದಿಲ್ಲ.

ಚಿತ್ರ 1 | ಡಿಎನ್ಎ ಸಮಗ್ರತೆಯ ಮೇಲೆ ನಿಶ್ಚಲತೆಯ ಪರಿಣಾಮ
ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಶವಪರೀಕ್ಷೆಗಳ ಪ್ಯಾರಾಫಿನ್ ವಿಭಾಗಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ DNA ಗುಣಮಟ್ಟವು ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಬದಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. ಸ್ಥಿರೀಕರಣ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ ಸಾರಗಳಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನ ಸರಾಸರಿ ತುಣುಕಿನ ಉದ್ದಗಳ ಡಿಎನ್‌ಎ ಇರುತ್ತದೆ. ಸ್ಥಳೀಯ ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಬಫರ್ಡ್ ನ್ಯೂಟ್ರಲ್ ಫಾರ್ಮಾಲಿನ್‌ನಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸಿದಾಗ ಮಾತ್ರ ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಂರಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಬಲವಾದ ಆಮ್ಲೀಯ ಬೌಯಿನ್ ಸ್ಥಿರೀಕರಣ ಅಥವಾ ಬಫರ್ ಮಾಡದ, ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಫಾರ್ಮಾಲಿನ್ ಬಳಕೆಯು DNA ಯ ಗಮನಾರ್ಹ ನಷ್ಟಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು. ಉಳಿದ ಭಾಗವು ಹೆಚ್ಚು ವಿಭಜಿತವಾಗಿದೆ.
ಎಡಭಾಗದಲ್ಲಿ, ತುಣುಕುಗಳ ಉದ್ದವನ್ನು ಕಿಲೋಬೇಸ್ ಜೋಡಿಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (kbp)

ಚಿತ್ರ 2 | ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಗುರಿಗಳ ಸಮಗ್ರತೆಯ ನಷ್ಟ
(a) ಎರಡೂ ಎಳೆಗಳ ಮೇಲೆ 3′-5′ ಅಂತರವು ಗುರಿಯ DNA ಯಲ್ಲಿ ವಿರಾಮಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಡಿಎನ್ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಇನ್ನೂ ಸಣ್ಣ ತುಣುಕಿನ ಮೇಲೆ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಡಿಎನ್‌ಎ ತುಣುಕಿನಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನೆಲಿಂಗ್ ಸೈಟ್ ಕಾಣೆಯಾಗಿದ್ದರೆ, ರೇಖೀಯ ವರ್ಧನೆ ಮಾತ್ರ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ. ಅತ್ಯಂತ ಅನುಕೂಲಕರ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ತುಣುಕುಗಳು ಒಂದಕ್ಕೊಂದು ಮರುಪೂರಣಗೊಳ್ಳಬಹುದು, ಆದರೆ ಇಳುವರಿಯು ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪತ್ತೆ ಮಟ್ಟಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಇರುತ್ತದೆ.
(b) ಬೇಸ್‌ಗಳ ನಷ್ಟ, ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಡಿಪ್ಯುರಿನೇಶನ್ ಮತ್ತು ಥೈಮಿಡಿನ್ ಡೈಮರ್ ರಚನೆಯಿಂದಾಗಿ, H-ಬಾಂಡ್‌ಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಇಳಿಕೆಗೆ ಮತ್ತು Tm ನಲ್ಲಿ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಉದ್ದವಾದ ವಾರ್ಮಿಂಗ್ ಹಂತದಲ್ಲಿ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯಿಂದ ಕರಗುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಕಠಿಣ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ ಅನೆಲ್ ಆಗುವುದಿಲ್ಲ.
(ಸಿ) ಪಕ್ಕದ ಥೈಮಿನ್ ಬೇಸ್‌ಗಳು ಟಿಟಿ ಡೈಮರ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ.
ಆಣ್ವಿಕ ರೋಗನಿರ್ಣಯದಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕಂಡುಬರುವ ಮತ್ತೊಂದು ಸಾಮಾನ್ಯ ಸಮಸ್ಯೆಯೆಂದರೆ ಫಿನಾಲ್-ಕ್ಲೋರೋಫಾರ್ಮ್ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಗುರಿಯ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳ ಕಡಿಮೆ-ಸೂಕ್ತ ಬಿಡುಗಡೆಯಾಗಿದೆ. ವಿಪರೀತ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಇದು ತಪ್ಪು ನಿರಾಕರಣೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿರಬಹುದು. ಕೋಶದ ಅವಶೇಷಗಳ ಕುದಿಯುವ ಲಿಸಿಸ್ ಅಥವಾ ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಮಯವನ್ನು ಉಳಿಸಬಹುದು, ಆದರೆ ಈ ವಿಧಾನವು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಸಾಕಷ್ಟು ಬಿಡುಗಡೆಯ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಪಿಸಿಆರ್ ಸಂವೇದನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.

ವರ್ಧನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧ

ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಸಬ್‌ಪ್ಟಿಮಲ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ಎಲ್ಲಾ ಅಂಶಗಳನ್ನು ವಿವರಿಸಲು ಪ್ರತಿಬಂಧಕವನ್ನು ಕಂಟೇನರ್ ಪರಿಕಲ್ಪನೆಯಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾಗಿ ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಅರ್ಥದಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿಬಂಧವು ಕಿಣ್ವದ ಚಟುವಟಿಕೆಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ, ಅಂದರೆ, ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್ ಅಥವಾ ಅದರ ಕೊಫ್ಯಾಕ್ಟರ್‌ನೊಂದಿಗಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೂಲಕ ತಲಾಧಾರ-ಉತ್ಪನ್ನ ಪರಿವರ್ತನೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಅಥವಾ ತಡೆಯುತ್ತದೆ (ಉದಾ, Taq DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ಗಾಗಿ Mg2+).
ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿನ ಘಟಕಗಳು ಅಥವಾ ಕಾರಕಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ವಿವಿಧ ಬಫರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಸಾರಗಳು ಕಿಣ್ವವನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಬಹುದು ಅಥವಾ ಅದರ ಕೊಫ್ಯಾಕ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು (ಉದಾ ಇಡಿಟಿಎ) ಬಲೆಗೆ ಬೀಳಿಸಬಹುದು, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಯಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಅಥವಾ ತಪ್ಪು ಋಣಾತ್ಮಕ PCR ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.
ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಘಟಕಗಳು ಮತ್ತು ಗುರಿ-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳ ನಡುವಿನ ಅನೇಕ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಸಹ 'PCR ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳು' ಎಂದು ಗೊತ್ತುಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ಕೋಶದ ಸಮಗ್ರತೆಯು ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯಿಂದ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಿದಾಗ ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ಮಾದರಿ ಮತ್ತು ಅದರ ಸುತ್ತಲಿನ ದ್ರಾವಣ ಮತ್ತು ಘನ ಹಂತದ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳು ಸಂಭವಿಸಬಹುದು. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, 'ಸ್ಕಾವೆಂಜರ್‌ಗಳು' ಕೋವೆಲೆಂಟ್ ಅಲ್ಲದ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಮೂಲಕ ಏಕ- ಅಥವಾ ಡಬಲ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ DNA ಯನ್ನು ಬಂಧಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಅಂತಿಮವಾಗಿ PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ನಾಳವನ್ನು ತಲುಪುವ ಗುರಿಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಣಕ್ಕೆ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಬಹುದು.
ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ದೇಹದ ದ್ರವಗಳಲ್ಲಿ ಇರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ವೈದ್ಯಕೀಯ ರೋಗನಿರ್ಣಯ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳಿಗೆ (ಮೂತ್ರದಲ್ಲಿ ಯೂರಿಯಾ, ಹಿಮೋಗ್ಲೋಬಿನ್ ಮತ್ತು ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಹೆಪಾರಿನ್), ಆಹಾರ ಪೂರಕಗಳು (ಸಾವಯವ ಘಟಕಗಳು, ಗ್ಲೈಕೊಜೆನ್, ಕೊಬ್ಬು, Ca2+ ಅಯಾನುಗಳು) ಮತ್ತು ಪರಿಸರದಲ್ಲಿನ ಘಟಕಗಳು (ಫೀನಾಲ್ಗಳು) , ಭಾರ ಲೋಹಗಳು)

ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರಚಲಿತವಿರುವ PCR ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾ ಮತ್ತು ಯುಕಾರ್ಯೋಟಿಕ್ ಜೀವಕೋಶಗಳು, ಗುರಿಯಲ್ಲದ DNA, ಅಂಗಾಂಶ ಮ್ಯಾಟ್ರಿಸಸ್‌ಗಳ DNA-ಬಂಧಿಸುವ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಮಾಲಿಕ್ಯೂಲ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಕೈಗವಸುಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್‌ಗಳಂತಹ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯ ಉಪಕರಣಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುತ್ತವೆ. ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ನಂತರ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳ ಶುದ್ಧೀಕರಣವು PCR ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಆದ್ಯತೆಯ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.
ಇಂದು, ವಿವಿಧ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಉಪಕರಣಗಳು ಅನೇಕ ಹಸ್ತಚಾಲಿತ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್‌ಗಳನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಬಹುದು, ಆದರೆ 100% ಚೇತರಿಕೆ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಗುರಿಗಳ ಶುದ್ಧೀಕರಣವನ್ನು ಎಂದಿಗೂ ಸಾಧಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ. ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಭಾವ್ಯ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳು ಇನ್ನೂ ಇರಬಹುದು ಅಥವಾ ಈಗಾಗಲೇ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಿರಬಹುದು. ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ವಿಭಿನ್ನ ತಂತ್ರಗಳು ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿವೆ. ಸೂಕ್ತವಾದ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನ ಆಯ್ಕೆಯು ಪ್ರತಿಬಂಧಕದ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ಗಮನಾರ್ಹ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು. ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಇತರ ಸಾಬೀತಾದ ವಿಧಾನಗಳು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವುದು ಅಥವಾ BSA ಯಂತಹ ಸೇರ್ಪಡೆಗಳನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸುವುದು.
ಆಂತರಿಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ ಗುಣಮಟ್ಟ ನಿಯಂತ್ರಣ (IPC) ಬಳಕೆಯಿಂದ PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳ ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಬಹುದು.
ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಕಿಟ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಎಲ್ಲಾ ಕಾರಕಗಳು ಮತ್ತು ಇತರ ಪರಿಹಾರಗಳಾದ ಎಥೆನಾಲ್, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ಐಸೊಪ್ರೊಪನಾಲ್ ಮತ್ತು ಫೀನಾಲ್ ಅನ್ನು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯಿಂದ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ತೊಳೆಯುವ ಹಂತದಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಕಾಳಜಿಯನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಬೇಕು. ಅವರ ಏಕಾಗ್ರತೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ಅವರು PCR ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದು ಅಥವಾ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಬಹುದು.