ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಹಸ್ತಕ್ಷೇಪ ಅಂಶಗಳು

ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಕೆಲವು ಮಧ್ಯಪ್ರವೇಶಿಸುವ ಅಂಶಗಳು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಎದುರಾಗುತ್ತವೆ.
ಪಿಸಿಆರ್‌ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂವೇದನೆಯಿಂದಾಗಿ, ಮಾಲಿನ್ಯವು ಪಿಸಿಆರ್ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವ ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸುಳ್ಳು ಸಕಾರಾತ್ಮಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ.
ಸುಳ್ಳು- negative ಣಾತ್ಮಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ವಿವಿಧ ಮೂಲಗಳು ಅಷ್ಟೇ ನಿರ್ಣಾಯಕ. ಪಿಸಿಆರ್ ಮಿಶ್ರಣದ ಒಂದು ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಗತ್ಯ ಭಾಗಗಳನ್ನು ಅಥವಾ ವರ್ಧನೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಸ್ವತಃ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಿದರೆ ಅಥವಾ ಹಸ್ತಕ್ಷೇಪ ಮಾಡಿದರೆ, ರೋಗನಿರ್ಣಯದ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನವನ್ನು ಅಡ್ಡಿಯಾಗಬಹುದು. ಇದು ಕಡಿಮೆ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು ಸುಳ್ಳು ನಕಾರಾತ್ಮಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.
ಪ್ರತಿಬಂಧದ ಜೊತೆಗೆ, ಮಾದರಿ ತಯಾರಿಕೆಗೆ ಮುಂಚಿತವಾಗಿ ಸಾಗಣೆ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಶೇಖರಣಾ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಿಂದಾಗಿ ಗುರಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಸಮಗ್ರತೆಯ ನಷ್ಟ ಸಂಭವಿಸಬಹುದು. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನ ಅಥವಾ ಅಸಮರ್ಪಕ ಸಂಗ್ರಹವು ಜೀವಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳ ಹಾನಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು. ಕೋಶ ಮತ್ತು ಅಂಗಾಂಶ ಸ್ಥಿರೀಕರಣ ಮತ್ತು ಪ್ಯಾರಾಫಿನ್ ಎಂಬೆಡಿಂಗ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ವಿಘಟನೆಯ ಪ್ರಸಿದ್ಧ ಕಾರಣಗಳು ಮತ್ತು ನಿರಂತರ ಸಮಸ್ಯೆ (ಅಂಕಿ 1 ಮತ್ತು 2 ನೋಡಿ). ಈ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಸೂಕ್ತವಾದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಣವು ಸಹ ಸಹಾಯ ಮಾಡುವುದಿಲ್ಲ.

ಚಿತ್ರ 1 | ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಮಗ್ರತೆಯ ಮೇಲೆ ನಿಶ್ಚಲತೆಯ ಪರಿಣಾಮ
ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯ ಗುಣಮಟ್ಟವು ಶವಪರೀಕ್ಷೆಯ ಪ್ಯಾರಾಫಿನ್ ವಿಭಾಗಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. ಸ್ಥಿರೀಕರಣ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ ಸಾರಗಳಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನ ಸರಾಸರಿ ತುಣುಕು ಉದ್ದಗಳ ಡಿಎನ್‌ಎ ಇತ್ತು. ಸ್ಥಳೀಯ ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಬಫರ್ಡ್ ತಟಸ್ಥ ಫಾರ್ಮಾಲಿನ್‌ನಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರವಾದಾಗ ಮಾತ್ರ ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಂರಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಬಲವಾದ ಆಮ್ಲೀಯ ಬೌಯಿನ್ ಫಿಕ್ಸೇಟಿವ್ ಅಥವಾ ಅನ್ಫಫರ್ಡ್, ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಸಿಡ್-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಫಾರ್ಮಾಲಿನ್ ಬಳಕೆಯು ಡಿಎನ್‌ಎಯ ಗಮನಾರ್ಹ ನಷ್ಟಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು. ಉಳಿದ ಭಾಗವು ಹೆಚ್ಚು mented ಿದ್ರಗೊಂಡಿದೆ.
ಎಡಭಾಗದಲ್ಲಿ, ತುಣುಕುಗಳ ಉದ್ದವನ್ನು ಕಿಲೋಬೇಸ್ ಜೋಡಿಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಕೆಬಿಪಿ)

ಚಿತ್ರ 2 | ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಗುರಿಗಳ ಸಮಗ್ರತೆಯ ನಷ್ಟ
(ಎ) ಎರಡೂ ಎಳೆಗಳ ಮೇಲೆ 3′ -5 ′ ಅಂತರವು ಗುರಿ ಡಿಎನ್‌ಎಯಲ್ಲಿ ವಿರಾಮಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಸಣ್ಣ ತುಣುಕಿನ ಮೇಲೆ ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಇನ್ನೂ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಡಿಎನ್‌ಎ ತುಣುಕಿನಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಎನೆಲಿಂಗ್ ಸೈಟ್ ಕಾಣೆಯಾಗಿದ್ದರೆ, ರೇಖೀಯ ವರ್ಧನೆ ಮಾತ್ರ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ. ಅತ್ಯಂತ ಅನುಕೂಲಕರ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ತುಣುಕುಗಳು ಪರಸ್ಪರ ಪುನರುಜ್ಜೀವನಗೊಳ್ಳಬಹುದು, ಆದರೆ ಇಳುವರಿ ಸಣ್ಣ ಮತ್ತು ಪತ್ತೆ ಮಟ್ಟಕ್ಕಿಂತ ಕೆಳಗಿರುತ್ತದೆ.
. ಉದ್ದವಾದ ತಾಪಮಾನ ಏರಿಕೆಯ ಹಂತದಲ್ಲಿ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯಿಂದ ಕರಗುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಕಠಿಣ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ ಅನಿಯಲ್ ಆಗುವುದಿಲ್ಲ.
(ಸಿ) ಪಕ್ಕದ ಥೈಮಿನ್ ನೆಲೆಗಳು ಟಿಟಿ ಡೈಮರ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ.
ಫೀನಾಲ್-ಕ್ಲೋರೊಫಾರ್ಮ್ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಆಣ್ವಿಕ ರೋಗನಿರ್ಣಯದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಸಂಭವಿಸುವ ಮತ್ತೊಂದು ಸಾಮಾನ್ಯ ಸಮಸ್ಯೆ ಗುರಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳ ಸೂಕ್ತಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಬಿಡುಗಡೆಯಾಗಿದೆ. ವಿಪರೀತ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಇದು ಸುಳ್ಳು ನಿರಾಕರಣೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಬಹುದು. ಜೀವಕೋಶದ ಅವಶೇಷಗಳ ಕುದಿಯುವ ಲೈಸಿಸ್ ಅಥವಾ ಕಿಣ್ವಕ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಮಯವನ್ನು ಉಳಿಸಬಹುದು, ಆದರೆ ಈ ವಿಧಾನವು ಸಾಕಷ್ಟು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಬಿಡುಗಡೆಯಿಂದಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಪಿಸಿಆರ್ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.

ವರ್ಧನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧ

ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಸಬ್‌ಪ್ಟಿಮಲ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ಎಲ್ಲಾ ಅಂಶಗಳನ್ನು ವಿವರಿಸಲು ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಕಂಟೇನರ್ ಪರಿಕಲ್ಪನೆಯಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾಗಿ ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಅರ್ಥದಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿಬಂಧವು ಕಿಣ್ವದ ಚಟುವಟಿಕೆಗೆ ಸೀಮಿತವಾಗಿದೆ, ಅಂದರೆ, ಇದು ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅಥವಾ ಅದರ ಕೋಫಾಕ್ಟರ್‌ನ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೂಲಕ ತಲಾಧಾರ-ಉತ್ಪನ್ನ ಪರಿವರ್ತನೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಅಥವಾ ತಡೆಯುತ್ತದೆ (ಉದಾ., ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ಗಾಗಿ ಎಂಜಿ 2+ ಎಂಜಿ 2+).
ಮಾದರಿ ಅಥವಾ ವಿವಿಧ ಬಫರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಕಾರಕಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ವಿವಿಧ ಬಫರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಸಾರಗಳು ಕಿಣ್ವವನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಬಹುದು ಅಥವಾ ಅದರ ಕೋಫಾಕ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು (ಉದಾ. ಇಡಿಟಿಎ) ಬಲೆಗೆ ಬೀಳಿಸಬಹುದು, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆಯಾಗುವುದು ಅಥವಾ ಸುಳ್ಳು negative ಣಾತ್ಮಕ ಪಿಸಿಆರ್ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.
ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕ್ರಿಯೆಯ ಘಟಕಗಳು ಮತ್ತು ಗುರಿ-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳ ನಡುವಿನ ಅನೇಕ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು 'ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳು' ಎಂದು ಗೊತ್ತುಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ಜೀವಕೋಶದ ಸಮಗ್ರತೆಯು ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯಿಂದ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸಿದ ನಂತರ ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಬಿಡುಗಡೆಯಾದ ನಂತರ, ಮಾದರಿ ಮತ್ತು ಅದರ ಸುತ್ತಮುತ್ತಲಿನ ಪರಿಹಾರ ಮತ್ತು ಘನ ಹಂತದ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳು ಸಂಭವಿಸಬಹುದು. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, 'ಸ್ಕ್ಯಾವೆಂಜರ್ಸ್' ಕೋವೆಲೆಂಟ್ ಅಲ್ಲದ ಸಂವಹನಗಳ ಮೂಲಕ ಏಕ ಅಥವಾ ಡಬಲ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಬಂಧಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಹಡಗನ್ನು ತಲುಪುವ ಗುರಿಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಣಕ್ಕೆ ಅಡ್ಡಿಯಾಗಬಹುದು.
ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಡಯಾಗ್ನೋಸ್ಟಿಕ್ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳಿಗೆ (ಮೂತ್ರದಲ್ಲಿ ಯೂರಿಯಾ, ರಕ್ತದಲ್ಲಿ ಹಿಮೋಗ್ಲೋಬಿನ್ ಮತ್ತು ಹೆಪಾರಿನ್), ಆಹಾರ ಪೂರಕಗಳು (ಸಾವಯವ ಘಟಕಗಳು, ಗ್ಲೈಕೊಜೆನ್, ಕೊಬ್ಬು, ಸಿಎ 2+ ಅಯಾನುಗಳು) ಮತ್ತು ಪರಿಸರದಲ್ಲಿನ ಘಟಕಗಳಲ್ಲಿ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳು ಇರುತ್ತವೆ

ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾ ಮತ್ತು ಯುಕ್ಯಾರಿಯೋಟಿಕ್ ಕೋಶಗಳು, ಗುರಿರಹಿತ ಡಿಎನ್‌ಎ, ಅಂಗಾಂಶದ ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್‌ಗಳ ಡಿಎನ್‌ಎ-ಬಂಧಿಸುವ ಸ್ಥೂಲ ಅಣುಗಳು ಮತ್ತು ಕೈಗವಸುಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್‌ಗಳಂತಹ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯ ಸಾಧನಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರಚಲಿತದಲ್ಲಿರುವ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ಕಾಣಬಹುದು. ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ನಂತರ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳ ಶುದ್ಧೀಕರಣವು ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಆದ್ಯತೆಯ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.
ಇಂದು, ವಿವಿಧ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಸಾಧನಗಳು ಅನೇಕ ಹಸ್ತಚಾಲಿತ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್‌ಗಳನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಬಹುದು, ಆದರೆ 100% ಚೇತರಿಕೆ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಗುರಿಗಳ ಶುದ್ಧೀಕರಣವನ್ನು ಎಂದಿಗೂ ಸಾಧಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ. ಸಂಭಾವ್ಯ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳು ಇನ್ನೂ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳಲ್ಲಿ ಇರಬಹುದು ಅಥವಾ ಈಗಾಗಲೇ ಜಾರಿಗೆ ಬಂದಿರಬಹುದು. ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ವಿಭಿನ್ನ ತಂತ್ರಗಳು ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿವೆ. ಸೂಕ್ತವಾದ ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ನ ಆಯ್ಕೆಯು ಪ್ರತಿರೋಧಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ಗಮನಾರ್ಹ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ. ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಇತರ ಸಾಬೀತಾದ ವಿಧಾನಗಳು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವುದು ಅಥವಾ ಬಿಎಸ್ಎಯಂತಹ ಸೇರ್ಪಡೆಗಳನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸುವುದು.
ಆಂತರಿಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಗುಣಮಟ್ಟ ನಿಯಂತ್ರಣ (ಐಪಿಸಿ) ಬಳಕೆಯಿಂದ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳ ಪ್ರತಿಬಂಧವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಬಹುದು.
ಎಥೆನಾಲ್, ಇಡಿಟಿಎ, ಸಿಇಟಾಬ್, ಎಲ್ಐಸಿಎಲ್, ಗುಸ್ಕ್ನ್, ಎಸ್‌ಡಿಎಸ್, ಐಸೊಪ್ರೊಪನಾಲ್ ಮತ್ತು ಫೀನಾಲ್, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯಿಂದ ಸಂಪೂರ್ಣ ತೊಳೆಯುವ ಹಂತದಿಂದ ಎಲ್ಲಾ ಕಾರಕಗಳು ಮತ್ತು ಇತರ ಪರಿಹಾರಗಳನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲು ಕಾಳಜಿ ವಹಿಸಬೇಕು. ಅವುಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ, ಅವರು ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದು ಅಥವಾ ತಡೆಯಬಹುದು.